Ultraschnelle Laserchirurgiesonde für Sub

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 20554 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Schaffung subepithelialer Hohlräume in vernarbten Stimmlippen durch ultraschnelle Laserablation kann bei der Lokalisierung injizierbarer therapeutischer Biomaterialien für eine verbesserte Behandlung von Stimmlippennarben hilfreich sein. Für die präzise Ablation von Oberflächengewebe wurden mehrere ultraschnelle Laserchirurgiesonden entwickelt; Diesen Sonden fehlt jedoch die enge Strahlfokussierung, die für die Ablation unter der Oberfläche in stark streuenden Geweben wie Stimmlippen erforderlich ist. Hier präsentieren wir eine miniaturisierte Sonde für die ultraschnelle Laserchirurgie, die für die Durchführung einer subepithelialen Ablation in Stimmlippen entwickelt wurde. Die Anforderung einer hohen numerischen Apertur für die Ablation unter der Oberfläche sowie der kleine Formfaktor und die seitlich abstrahlende Architektur, die für den klinischen Einsatz erforderlich sind, führten zu einem anspruchsvollen optischen Design. Eine gehemmte Kopplung, die eine Kagome-Hohlkern-Photonenkristallfaser leitete, lieferte ultrakurze Impulse im Mikro-Joule-Bereich von einem Faserlaser mit hoher Wiederholungsrate zu einem speziell angefertigten miniaturisierten Objektiv, erzeugte einen 1/e2-Fokusstrahlradius von 1,12 ± 0,10 μm und deckte einen 46 × ab 46 μm2 Scanbereich. Die Sonde könnte bis zu 3,8 μJ-Impulse bei einer Übertragungseffizienz von 40 % durch das gesamte System an die Gewebeoberfläche abgeben und so deutlich höhere Fluenzen in der Brennebene liefern, als für die subepitheliale Ablation erforderlich wären. Um die chirurgische Leistung zu beurteilen, führten wir Ablationsstudien an frisch exzidierten Hemilaryngen von Schweinen durch und stellten fest, dass großflächige subepitheliale Hohlräume in den Stimmlippen erzeugt werden konnten, indem die Sondenspitze mithilfe externer Tische mechanisch über die Gewebeoberfläche verschoben wurde. Schließlich zeigte die Injektion eines Modellbiomaterials in einen 1 × 2 mm2 großen Hohlraum, der 114 ± 30 μm unter der Oberfläche des Stimmlippenepithels erzeugt wurde, eine verbesserte Lokalisierung im Vergleich zur direkten Injektion in das Gewebe ohne Hohlraum, was darauf hindeutet, dass unsere Sonde für prä- Klinische Bewertung injizierbarer therapeutischer Biomaterialien für die Stimmlippennarbentherapie. Mit zukünftigen Entwicklungen könnte das hier vorgestellte chirurgische System die Behandlung von Stimmlippennarben im klinischen Umfeld ermöglichen.

Narbenbildung an der Stimmlippe (VF) ist eine Hauptursache für Stimmstörungen1,2. Als unerwünschte Folge der chirurgischen Entfernung von VF-Läsionen kann die VF-Narbenbildung zu schwerer Dysphonie führen und sich negativ auf die Lebensqualität auswirken3,4. Derzeit gibt es keine wirksame Behandlung für chronisch vernarbtes VF5. Die Lamina propria, eine subepitheliale Gewebeschicht, die hauptsächlich aus Kollagen-, Elastin- und Retikulinfasern besteht, ist maßgeblich für das VF-Vibrationsphänomen verantwortlich und reagiert sehr empfindlich auf Narbenbildung. Viele Biomaterialien auf Hydrogelbasis wurden entwickelt, um vernarbtes VF6,7,8,9 zu reparieren. Eine suboptimale Lokalisierung führt jedoch zu einer schlechten Wiederholbarkeit der Behandlung10,11,12,13,14. Bei der Injektion in die oberflächliche Lamina propria (SLP) treten Probleme auf, da das injizierte Biomaterial eher in das steife Narbengewebe eindringt als hinein. Daher besteht Bedarf an einer Methode zur präzisen Lokalisierung von Biomaterialien innerhalb des vernarbten SLP unter Vermeidung zusätzlicher Narbenbildung.

Der ultraschnelle Laserablationsprozess beruht auf einer schnellen Multiphotonenabsorption in der Brennebene, was zu einer Eingrenzung der subfokalen Volumenenergie und einer minimalen thermischen Schädigung des umgebenden Gewebes führt15,16,17,18. Ein derart hoher Grad an räumlicher und thermischer Eingrenzung ermöglicht eine präzise Materialentfernung im Inneren von Gewebemassen. Um den Herausforderungen der VF-Narbenbildung zu begegnen, schlug unsere Gruppe eine Behandlung vor, bei der durch ultraschnelle Laserablation ein Biomaterial-Injektionsraum innerhalb des SLP geschaffen wird19,20,21. Unter Verwendung eines Tischmikroskops, das mit einem Objektiv mit numerischer Apertur (NA) von 0,75 und einem Femtosekunden-Faserlaser mit hoher Wiederholungsrate ausgestattet ist, haben Hoy et al. zeigten die Bildung subepithelialer Hohlräume in exzidiertem Schweine-VF ~ 100 μm unter der Epitheloberfläche19, was deutlich innerhalb des SLP liegt, wenn man bedenkt, dass die Epitheldicke von VF bei Menschen, Hunden und Schweinen typischerweise 50–80 μm beträgt22,23. Weitere Ex-vivo-Studien von Hoy et al. zeigten die Injektion eines Modellbiomaterials in abgetragene Hohlräume, die in herausgeschnittenen, vernarbten Backentaschen von Hamstern entstanden waren20. Die Autoren zeigten, dass die Injektion eines Modellbiomaterials (PEG30) in Hohlräume den Rückfluss deutlich reduzierte und die Lokalisierung verbesserte, verglichen mit der Injektion von Biomaterial nur in Narbengewebe. In jüngerer Zeit haben Gabay et al. zeigten eine langfristige Retention von PEG30 in subepithelialen Hohlräumen, die in einem In-vivo-Modell mit vernarbter Hamsterbackentasche erzeugt wurden24. Mithilfe des gleichen Faserlasers und Tischsystems wie Hoy et al. stellten Gabay und Co-Autoren fest, dass PEG30 bis zu zwei Wochen lang in den Hohlräumen verblieb, was darauf hindeutet, dass die Injektion in Hohlräume die langfristige Biomaterialretention verbessert. Obwohl diese Ergebnisse ermutigend waren, begrenzten die große Optik (z. B. Mikroskopobjektiv, Galvo-Scanning-Spiegelpaar, Scan-/Röhrenlinsen usw.) und die Freiraumabgabe des Laserlichts die klinische Umsetzung. Daher ist eine flexible Abgabe eng fokussierter ultrakurzer Impulse durch miniaturisierte optische Systeme erforderlich, um unsere VF-Narbentherapie in die Klinik zu übertragen.

Für eine klinisch realisierbare ultraschnelle Laserchirurgie wurden verschiedene miniaturisierte chirurgische Sonden entwickelt25,26,27,28,29,30. Diese Sonden verwendeten eine Fokussierungsoptik mit niedriger NA, um eine schnelle Oberflächenablation von Weich- und Hartgewebe zu ermöglichen. Bei der ultraschnellen Laserablation erfordert ein schwach fokussierter Strahl hohe Spitzenleistungen, um die Schwellenwerte für die Gewebeablation zu überschreiten. Aufgrund des Vorhandenseins von Gewebestreuern sind beim Anvisieren von Strukturen unter der Oberfläche sogar noch höhere Spitzenleistungen erforderlich. Über eine gewebespezifische kritische Spitzenleistung hinaus kann die Selbstfokussierung dazu führen, dass der Strahl oberhalb der Zielfokusebene zusammenbricht, was zur Ablation oberflächlicher Gewebeschichten führt31. Daher ist eine Fokussierung ultrakurzer Laserimpulse mit hoher NA erforderlich, um die Bildung von Hohlräumen über eine subepitheliale Ebene einzuleiten und gleichzeitig die schädlichen Auswirkungen der Selbstfokussierung zu vermeiden. Da darüber hinaus Narben auf der medialen VF-Oberfläche klinisch relevanter für die Stimmproduktion sind, ist die nach vorne gerichtete Architektur früherer Sonden-Iterationen für die vorgeschlagene Narben-VF-Therapie schlecht geeignet.

In diesem Artikel stellen wir eine ultraschnelle Laserchirurgiesonde vor, die entwickelt wurde, um unsere Narben-VF-Therapie in die Klinik zu übertragen. Die hier beschriebene Sonde verbessert frühere Designs, indem sie ein miniaturisiertes Objektiv mit hoher NA verwendet, um die Ablation von subepithelialem Gewebe zu erleichtern. Wir nutzen eine seitlich abstrahlende Architektur und ein externes Betätigungssystem, um automatisiertes Scannen über eine große subepitheliale Ebene in einem für endoskopische Kehlkopfchirurgie geeigneten Formfaktor zu ermöglichen. Um die chirurgische Leistungsfähigkeit der Sonde zu demonstrieren, führen wir eine subepitheliale Hohlraumbildung und eine Biomaterialinjektion in exzidierten Hemilaryngen von Schweinen durch, um eine praktikable Therapie für vernarbtes menschliches Kammerflimmern zu finden.

Die chirurgische Sonde muss mehrere wichtige Anforderungen für den klinischen Einsatz erfüllen: 1) Flexible Abgabe ultrakurzer Laserimpulse an den interessierenden chirurgischen Bereich (ROI), 2) Fokussierungsoptik mit hoher NA, um Schäden durch Unschärfe zu vermeiden, 3) seitlich abstrahlende Architektur, 4) großflächiges Strahlscannen, um die Bildung großer subepithelialer Hohlräume zu ermöglichen, und 5) ein kleiner Formfaktor für die Integration in vorhandene mikrolaryngeale chirurgische Instrumente. Unter Berücksichtigung all dieser Aspekte haben wir eine miniaturisierte Sonde entworfen, wie in Abb. 1a dargestellt.

Überblick über das ultraschnelle Laserchirurgiesystem. (a) Optomechanisches Design der Chirurgiesonde. Die Sonde fokussiert den Laserstrahl (rote Spur) mithilfe eines miniaturisierten Objektivs, das aus einem Saphirfenster (1), einem reflektierenden Mikroprisma (2), einer ZnS-Linse (3) und zwei CaF2-Linsen (4 und 5) besteht, auf eine Gewebeebene unter der Oberfläche ). Alle optischen Komponenten sind in einem 304SS-Injektionsrohr (6) untergebracht und die Abstände zwischen den drei Linsen werden durch Messingabstandshalter (7) eingestellt. Der Ort der gescannten Kagome-Faserspitze (8) wird in Zemax abgebildet, um den Weg der Strahlen von der Brennebene zurück durch das Objektiv zu simulieren. Ein PMMA-Einsatz (9) zentrierte die Faser im inneren Hohlraum eines piezoelektrischen Rohrs (10). Das piezoelektrische Rohr (10) wurde mithilfe eines präzise gedrehten Epoxidstopfens in einem 304SS-Innengehäuse (11) zentriert. Das Innengehäuse (11) wurde innerhalb des Injektionsrohrs (6) zentriert, um die Piezo-HCPCF-Anordnung auf das miniaturisierte Objektiv auszurichten. Zwei Außengehäuse (12, 13) wurden hinzugefügt, um das hintere Ende der Sonde am miniaturisierten Objektiv zu befestigen. (b) Optisches Schema eines miniaturisierten Objektivs. Eine Strahlverfolgung zeigt verschiedene Einstrahlwinkel von der Faserspitze durch das System. (c) Endmontage und Verpackung des miniaturisierten Objektivs in einer Injektionsröhre.

Um eine flexible Zuführung von Laserlicht zur chirurgischen Sonde zu ermöglichen, verwendeten wir eine von der Forschungsgruppe von Fetah Benabid entwickelte Hohlkern-Photonikkristallfaser (HCPCF) vom Kagome-Typ. Kagome-HCPCFs sind aufgrund ihrer hohen Spitzenbelastbarkeit, ihrer geringen Gruppengeschwindigkeitsdispersion (GVD) und ihrer effizienten Übertragung ultrakurzer NIR-Impulse ideale Wellenleiterkandidaten für die ultraschnelle Laserchirurgie32. Konkret verwendeten wir einen 6 m langen Kagome-HCPCF mit 7 Zellen und einem Innenkerndurchmesser von ~ 52 μm, der eine niedrige GVD (–437 fs2/m) und eine geringe Dämpfung (0,1 dB/m) bei 1035 nm aufweist. Die distale HPCCF-Länge wurde in ein piezobasiertes Lissajous-Strahllenkungselement integriert, ähnlich wie in früheren Studien27,29,30. Um die Piezo-HCPCF-Baugruppe zu bauen, haben wir zunächst Leitungen an das proximale Ende eines Vierquadranten-Piezokeramikrohrs (EBL Photonics Inc.) gelötet, die Leitungen mit Epoxidharz beschichtet und den Epoxidstopfen diamantgedreht, um ihn an den Innendurchmesser anzupassen des entsprechenden Metallgehäuses. Anschließend haben wir mithilfe eines präzisionsgefertigten PMMA-Einsatzes ein 17 mm langes Stück der Kagome HPCCF-Spitze aus dem distalen Ende des Piezokeramikrohrs zentriert. Nach der Ausrichtung haben wir HPCCF, PMMA-Einsatz und Piezorohr mit Epoxidharz zusammengeklebt. Wir haben das proximale Ende der Faser mit einem Kunststoffschlauch (FT020, Thorlabs) umhüllt, um einen Faserbruch zu verhindern, bevor wir die Piezofaserbaugruppe für weitere Tests in die externe Betätigungsbaugruppe integriert haben (Abschnitt „Mechanisches Design“).

Die chirurgische Sonde erfordert eine Fokussierung ultrakurzer Laserimpulse mit hoher NA, die durch den Kagome HCPCF mit niedriger NA abgegeben werden, um eine lokalisierte Ablation unterhalb des VF-Epithels einzuleiten, was die Entwicklung einer maßgeschneiderten miniaturisierten Fokussierungsoptik erforderlich macht. Darüber hinaus erfordern die für die Ablation erforderlichen hohen Pulsenergien und die für den klinischen Einsatz erforderlichen kleinen Formfaktoren eine sorgfältige Auswahl der Linsenmaterialien, um optische Nichtlinearitäten innerhalb des Systems zu vermeiden. Wir verwendeten Zemax für Design, Optimierung und Toleranzanalyse eines miniaturisierten Objektivs33. Die seitlich abstrahlende Architektur der Sonde erforderte, dass der geometrische Abstand zwischen der Brennebene und der nächstgelegenen Linsenoberfläche ≥ 4 mm betrug. Diese Einschränkung sowie die hohe NA und der kleine Formfaktor, die für den klinischen Einsatz erforderlich sind, führten zu einem anspruchsvollen optischen Design. Das Objektiv wurde für die zentrale Wellenlänge unserer Laserlichtquelle von 1035 nm, Linsendurchmesser ≤ 6 mm optimiert, um einen kleinen Formfaktor zu gewährleisten, und Meerwasserimmersion zur Fokussierung im Gewebe. Um Selbstfokussierungseffekte während der Operation zu vermeiden, haben wir das Objektivdesign für die höchstmögliche gewebeseitige NA optimiert und gleichzeitig die Herstellungstoleranzen der Linse berücksichtigt, um die Herstellbarkeit sicherzustellen. Schließlich haben wir einen Arbeitsabstand von > 100 μm angestrebt, um eine lokalisierte Hohlraumbildung unterhalb des VF-Epithels zu ermöglichen.

Das endgültige Objektivdesign (Tabelle 1) hatte eine nominale gewebeseitige NA von 0,47 und einen Arbeitsabstand von 112 μm bei der Fokussierung im Meerwasser und entsprach damit unseren Designspezifikationen. Um die theoretische Strahlgröße der Brennebene abzuschätzen, verwendeten wir das Modul „Diffraction Encircled Energy“ (DEE) in Zemax. Hier wurden die Eingangsstrahlparameter vom Kagome HPCCF definiert, wobei die Gaußsche Strahlkürzung bei der minimalen freien Apertur des optischen Systems berücksichtigt wurde. Wir haben einen 1/e2-Brennfleckradius von 0,94 μm über ein Sichtfeld von 47 × 47 μm2 für den Betrieb in Meerwasser geschätzt, was einer –25-fachen Verkleinerung der ± 0,55 mm Faserspitzenauslenkung entspricht. Ein Strehl-Verhältnis von > 0,80 zeigte eine beugungsbegrenzte Leistung über das gewebeseitige FOV an.

Das miniaturisierte Objektiv enthält zwei Calciumfluorid (CaF2)-Asphären, eine Zinksulfid (ZnS)-Asphäre, ein reflektierendes Mikroprisma (Tower Optical Inc.) und ein Saphirfenster (Tower Optical Inc.) (Abb. 1b). Die drei Linsen bilden die gescannte Faserspitze auf eine subepitheliale Gewebeebene ab, das Mikroprisma faltet den Strahlengang um 90°, um eine radiale Fokussierung zu ermöglichen, und das Saphirfenster bietet eine Gewebekontaktfläche. Da für die subepitheliale Ablation hohe Pulsenergien erforderlich sind, mussten wir die nichtlinearen optischen Eigenschaften ausgewählter Materialien berücksichtigen. Aufgrund der vernachlässigbaren Multiphotonenabsorption in CaF2 erwarten wir eine lineare Übertragung von ≥ 12 μJ, 1 ps-Pulsen, weit höher als die für die Ablation erforderlichen Pulsenergien34. Dies entspricht einer Spitzenintensität von ~ 380 GW/cm2 an der faserseitigen Oberfläche der ersten CaF2-Linse, dh der kleinsten Strahlgröße an irgendeiner Oberfläche innerhalb des Objektivs. Andererseits weist ZnS eine starke nichtlineare Brechung und Absorption auf. Die relativ geringe Spitzenintensität (große Strahltaille) innerhalb der ZnS-Linse sollte diese unerwünschten nichtlinearen Effekte jedoch abschwächen. Insbesondere ist die an der ZnS-Linse erwartete Spitzenintensität von 0,26 GW/cm2 niedriger als der experimentell bestimmte Schwellenwert von 3,2 GW/cm2, der erforderlich ist, um eine nennenswerte Multiphotonenabsorption auszulösen29.

Die Herstellung und Montage des miniaturisierten Objektivs wurde zuvor von Jeon et al.33 beschrieben. Die maximale freie Apertur des Objektivs von ~ 4,8 mm ermöglichte die Unterbringung der Linsen in einem Edelstahl-Injektionsrohr mit 6 mm Durchmesser (4TW, Vita Needle Company, Abb. 1c) und wir verwendeten präzisionsgeschnittene Messingabstandshalter, um geeignete Abstände zwischen den einzelnen Linsen einzustellen.

Um eine großflächige Gewebeablation zu ermöglichen, planten wir zunächst, die Sondenspitze (dh das Ablations-FOV) mithilfe von Mikromotoren, die in der Sonde integriert sind, mechanisch abzutasten. Konkret würden ein piezoelektrischer linearer Mikromotor (SQL-RV-1.8, New Scale Technologies) und ein bürstenloser rotierender Mikromotor (0602-B, MICROMO), die hinter der Piezofaseranordnung untergebracht sind, die Sondenspitze verschieben und damit auch die Ablations-FOV in einem Pseudorastermuster über eine große subepitheliale Ebene unter Beibehaltung eines für die Kehlkopfchirurgie geeigneten Formfaktors. Während dieses mechanische Scansystem bei ersten Tests gut funktionierte, versagte es bei Ablationsexperimenten. Aufgrund seines geringen Stillstandsdrehmoments war der lineare Mikromotor nicht in der Lage, die Sondenspitze zu bewegen, während sie mit der Gewebeoberfläche in Kontakt stand. Angesichts dieses Problems haben wir uns entschieden, die Sonde in ein externes Betätigungssystem zu integrieren (Abb. 2a). In dieser Konfiguration wurde ein für einen Computermonitor konzipierter Gelenkarm umfunktioniert, um eine flexible Positionierung der Chirurgiesonde zu ermöglichen. Das distale Ende des Arms enthält zwei lineare Translationstische, einen dreiachsigen motorisierten Tisch (MAX302, Thorlabs) und die Sonde. Der Gelenkarm und die linearen Tische wurden verwendet, um die Sondenspitze auf der Stimmlippenoberfläche zu positionieren (Abb. 2b), während das automatische Scannen des Ablations-FOV über eine große Subepithelebene durch Verschieben des proximalen Endes der Sonde mithilfe von zwei ermöglicht wurde -Schrittmotoren, die an der motorisierten Bühne angebracht sind. Diese Konfiguration vereinfachte das gesamte Sondendesign und ermöglichte die Unterbringung der Piezofaser und der miniaturisierten Objektiv-Unterbaugruppen in einem einzigen, ca. 30 cm langen Injektionsrohr. Die Gesamtlänge des Geräts beträgt ca. 40 cm, ähnlich wie bei Endoskopen, die derzeit in der Kehlkopfchirurgie verwendet werden, während der Sondendurchmesser von 6 mm eine ausreichende Sichtfreiheit beim Betrieb in einem starren Laryngoskop für die Mikrolarynxchirurgie ermöglicht.

(a) Chirurgisches System mit in das externe Betätigungssystem integrierter Sonde. (b) Platzierung der Sondenspitze auf der unteren VF-Oberfläche von Schweinen. (c) Der Versuchsaufbau umfasste eine Halbwellenplatte (HWP), einen polarisierenden Strahlteiler (PBS), einen Strahlblock (BB), eine Faserkopplungslinse (CL), einen fünfachsigen Tisch (5A) und ein externes Betätigungssystem (EAS). . Die Sammeloptik (CO) wurde basierend auf der Auflösung und/oder der Ausgangsstrahlgröße modifiziert, die für den Strahlprofiler (BP), den Leistungsmesser (PM), den Autokorrelator (AC) oder das Spektrometer (SM) erforderlich ist.

Zur Sondencharakterisierung verwendeten wir den in Abb. 2c gezeigten Versuchsaufbau. Für alle Ablationsexperimente verwendeten wir einen Yb-Faserlaser (40 W, 1035 ± 5 nm, 300 fs – 10 ps, 10 kHz – 50 MHz, Monaco 1035–40-40, Coherent Inc.). Vor den Experimenten haben wir mit der von Siegman35 beschriebenen Methode einen Laserstrahl-Qualitätsfaktor von \(M^{2} = 1,07 \pm 0,04\) gemessen. Während der Ablationsstudien verwendeten wir entweder 1,1 ps- oder 5 ps-Impulse, um eine Selbstfokussierung zu vermeiden, wenn wir auf Gewebestrukturen unterhalb der Oberfläche innerhalb der stark streuenden VF-Gewebe zielten31. Darüber hinaus verwendeten wir eine Laserwiederholungsrate von 500 kHz, um eine Ablation mit hoher Geschwindigkeit zu erreichen und gleichzeitig eine niedrige Pulsüberlappungsrate beizubehalten, um akkumulative Gewebeerwärmungseffekte zu vermeiden16,36,37,38.

Wir verwendeten ein nichtlineares Tischmikroskop, um eine volumetrische Abbildung von abgetragenem VF-Gewebe durchzuführen. Kurz gesagt, ein Ti:Saphir-Laseroszillator (0,75 W, 775 nm, 100 fs, 80 MHz, Mai Tai, Spectra Physics) ermöglicht die Zwei-Photonen-Autofluoreszenz-Bildgebung (TPAF) über ein Sichtfeld von 400 × 400 μm2, wenn der Laserstrahl rasterabgetastet wird auf das VF-Gewebe durch zwei galvanometrische Spiegel und erweitert auf die hintere Apertur eines 20 × 0,75 NA-Objektivs (Nikon Plan Apo, Deckglas korrigiert). Die Emission wird epi-gesammelt, durch den entsprechenden Filter (BG39, Schott) umgeleitet und von einer Photomultiplierröhre (H7422-40, Hamamatsu) erfasst. Bilder werden durch Mittelung von 10 Bildern generiert. Die galvanometrischen Spiegel, der Tisch und das PMT werden von der MPScan-Software39 gesteuert und synchronisiert.

Wir haben den Kagome HPCCF mithilfe des in Abb. 2c gezeigten Versuchsaufbaus charakterisiert, wobei das miniaturisierte Objektiv entfernt wurde. Eine Frontalansicht der Faser- und Faserverlust-/Dispersionsspektren ist in Abb. 3a dargestellt. Die gemessene Übertragung betrug 70 %, wenn 300 fs-, 1,1 ps- und 5 ps-Impulse durch die 6 m lange Faser unter Verwendung einer \(f = 100\) mm-Kopplungslinse geliefert wurden (Abb. 3b), was bei Betrachtung einer Kopplungseffizienz von ~ 81 % entspricht Faserverluste (0,1 dB/m bei 1035 nm, Abb. 3a). Wir haben einen Fasermodenfeldradius von \(w_{MF} = 17 \pm 1\) μm ermittelt, indem wir das Strahlprofil innerhalb des Faserkerns mit einem 40-fach-Objektiv (0,75 NA, UPlanFLN, Olympus) und einem Strahlprofilmessgerät (SP928) abgebildet haben , Ophir Photonics) und einer geeigneten Tubuslinse, die gut mit dem erwarteten Wert von \(w_{MF} = 18\) μm übereinstimmt. Wir haben die numerische Apertur der Faser geschätzt, indem wir das Ausgangsstrahlprofil an mehreren axialen Stellen im Fernfeld abgebildet, die gemessenen Strahlradien als Funktion des Abstands von der Faserspitze aufgetragen und den entsprechenden Divergenzwinkel berechnet haben. Die gemessenen 0,022 ± 0,002 NA stimmten gut mit dem erwarteten Wert von ~ 0,02 überein.

Charakterisierung von Kagome-Fasern. (a) Gemessener Verlust und berechnete Dispersionsspektren der Kagome-Faser. Der Einschub zeigt die Vorderansicht der Faser. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. (b) Gemessene Übertragungskurven durch eine 6 m lange Kagome-Faser für Impulse mit 300 fs, 1,1 ps und 5 ps und für die gesamte Chirurgiesonde bei 1,1 ps. (c) Pulskompressionsverhältnis (PCR) am Faserausgang von 300 fs (blau), 1,1 ps (grün) und 5 ps (rot) Impulsen als Funktion der Eingangsimpulsenergie. Datenpunkte stellen mit dem Autokorrelator (AC) gemessene FHWM-Pulsbreiten dar, während durchgezogene Linien aus Simulationen vorhergesagte Pulsbreiten darstellen. Fehlerbalken stellen 95 %-Konfidenzintervalle von sech2-Anpassungen an Autokorrelator-Impulsbreitenmessungen dar. (d) Autokorrelatorspur eines 300-fs-Impulses am Fasereingang (gepunktete Linie) und -ausgang (durchgezogene Linie) für eine Eingangsimpulsenergie von 10 μJ. (e) Pulsspektrum eines 300-fs-Pulses am Fasereingang (gepunktete Linie) und -ausgang (durchgezogene Linie) für eine Eingangspulsenergie von 10 μJ. (f) Lissajous-Scanning-Simulationen, die den Einfluss der lateralen Translationsgeschwindigkeit auf das Pulsablagerungsprofil zeigen. Eine Translationsgeschwindigkeit von 1 mm/s führt zu einer vollständigen Abdeckung, während 2 mm/s und 3 mm/s eine Abdeckung von 94 % bzw. 81 % bieten. Der Farbbalken rechts zeigt die Anzahl der überlappenden Impulse im gesamten Scanbereich an. Die Laserwiederholungsrate betrug 500 kHz für die in (b–e) gesammelten Daten.

Um den Einfluss der chromatischen Dispersion und der optischen Nichtlinearitäten innerhalb der Kagome-Faser abzuschätzen, haben wir die Impulsbreite und das Spektrum am Fasereingang/-ausgang mithilfe eines auf Simulation und Experimenten basierenden Ansatzes charakterisiert. Während lineare Dispersion und nichtlineare Effekte in der Kagome-Faser minimal sein sollten, kann die Übertragung der für die Operation erforderlichen Hochenergieimpulse dennoch zu erheblichen Impulsverzerrungen führen. Durch den optischen Kerr-Effekt kann ein Impuls mit hoher Spitzenintensität den momentanen Brechungsindex der Faser modulieren und so eine nichtlineare Phasenverschiebung über den Impuls erzeugen. Dieser Effekt, die Selbstphasenmodulation (SPM), erzeugt zusätzliche Spektralkomponenten an der Vorder- und Hinterkante des Impulses, während er sich entlang der Faserlänge bewegt, und kann die Impulsverbreiterung in normalerweise dispersiven Medien beschleunigen. Bei einer anomal dispersiven Faser kann SPM je nach Fasergeometrie, Länge und Spitzenimpulsintensität innerhalb der Faser die anfängliche Impulsbreite verbreitern, komprimieren oder beibehalten.

Wir haben die Impulsausbreitung durch die Kagome-Faser mit der symmetrischen Fourier-Split-Step-Methode (SFSS) simuliert. Details zur SFSS-Methode werden von Agrawal et al.40 beschrieben. Im Allgemeinen gibt es für nichtlineare optische Systeme keine analytischen Lösungen für die Maxwell-Gleichungen, und zur Beschreibung der Lichtausbreitung in Wellenleitern wird üblicherweise eine näherungsweise skalare Form der Wellengleichung, die nichtlineare Schrödinger-Gleichung, verwendet.

wobei \(\alpha\) der lineare Absorptionskoeffizient ist, \(\beta_{2}\) und \(\beta_{3}\) Dispersionskoeffizienten zweiter und dritter Ordnung sind und \(\omega_{0} \) ist die Kreisfrequenz der Trägerwelle. Gleichung (1) geht davon aus, dass die Intensität des Impulses, \(A(z,t)\), langsam in Bezug auf die Wellenlänge variiert (dh eine sich langsam ändernde Hüllkurvennäherung). Der nichtlineare Parameter \(\gamma\) ist definiert als \(\gamma = {{\omega_{0} n_{2} } \mathord{\left/ {\vphantom {{\omega_{0} n_{2 } } {cA_{eff} }}} \right. \kern-\nulldelimiterspace} {cA_{eff} }}\), wobei \(c\) die Lichtgeschwindigkeit ist, \(n_{2}\) ist der nichtlineare Brechungsindex von Luft (\(n_{2} = 3,01 \times 10^{ - 23} {\text{ m}}^{2} {\text{/W}}\) bei 800 nm41), und \(A_{eff}\) ist die effektive Strahlfläche, die durch den Modenfeldradius der Faser definiert wird. Der erste und zweite Term auf der rechten Seite von Gl. (1) Berücksichtigung von SPM bzw. Selbststeilheit. Die Feldhüllkurve des eingegebenen hyperbolischen Sekantenimpulses beträgt 40:

Dabei ist \(P_{0}\) die Impulsspitzenleistung und \(\tau_{0}\) die Impulsbreite. Die in Gl. verwendete Impulsbreite. (2) kann durch die Beziehung \(\tau = 1,76\tau_{0}\) in die Vollbreite-bei-Halbmaximum-Pulsbreite (FWHM) umgewandelt werden, und \(P_{0}\) ist definiert as42:

wobei E die Impulsenergie ist. Für unsere Simulationen haben wir \(\alpha = 0,023{\text{ m}}^{ - 1}\) und \(\beta_{2} = - 4,37 \times 10^{ - 4} {\text{ ps) angenommen }}^{2} {\text{/m}}\), wie vom Faserhersteller angegeben. Wir setzen \(\beta_{3} = 0\), da die Dispersion dritter Ordnung nur in der Nähe der Wellenlänge der Nulldispersion, in unserem Fall ~ 730 nm, signifikant ist und weil Autokorrelatorspuren nicht die asymmetrische Hinterkante zeigten, die mit der Dispersion dritter Ordnung verbunden ist40 . Wir haben zeitliche und räumliche Schrittgrößen basierend auf den in43 beschriebenen Methoden ausgewählt. Eine hohe räumliche und zeitliche Diskretisierung stellte die Konvergenz der Simulation sicher und ermöglichte eine genaue Schätzung der Ausgangsimpulsform.

Wir haben die Impulsausbreitung durch die Kagome-Faser für drei Impulsbreiten simuliert: 300 fs, 1,1 ps und 5 ps. Simulationen sagten minimale Impulsverzerrungen voraus, wenn Impulse mit 1,1 ps und 5 ps durch die Kagome-Faser geliefert werden. Bei diesen längeren Pulsdauern waren die Spitzenintensitäten niedrig und nichtlineare Effekte vernachlässigbar; Die zeitlichen Pulsprofile blieben bis zu einer Eingangspulsenergie von 10 μJ praktisch unverändert (Abb. 3c). Für 300-fs-Pulse zeigte unser Modell Veränderungen in der Ausgangspulsbreite bei steigenden Pulsenergien, wahrscheinlich aufgrund des Zusammenspiels zwischen SPM und anomaler Dispersion in der Kagome-Faser. Unsere Simulationen sagten eine minimale Pulsbreite von \(\tau \sim 240{\text{ fs}}\) bei 6 μJ und eine Erholung auf \(\tau \sim 260{\text{ fs}}\) bei 10 μJ voraus .

Anschließend haben wir die Pulsbreite und die Spektren am Fasereingang und -ausgang für einen Bereich von Pulsenergien mit einem Autokorrelator (pulseCheck, APE GmbH) und einem Spektrometer (Mini4096CL, Avantes) charakterisiert. Bei 1,1-ps- und 5-ps-Impulsen beobachteten wir minimale Schwankungen der Impulsbreite am Faserausgang, was gut mit den Simulationen übereinstimmt. Für 300-fs-Pulse haben wir eine minimale Pulsbreite von \(\tau \sim 235{\text{ fs}}\) bei 7 μJ gemessen, gefolgt von einer Erholung auf \(\tau \sim 265{\text{ fs}} }\) bei 10 μJ (Abb. 3c). In diesem Fall entwickelten die Ausgangsimpulse „Sockel“ bei ≥ 9 μJ (Abb. 3d), was zu größeren Messunsicherheiten führte. Sockel könnten durch SPM-induzierte Spektren verursacht worden sein, die in der anomal dispersiven Kagome-Faser nicht kompensiert wurden44. Tatsächlich beobachteten wir bei Verwendung hochenergetischer 300-fs-Impulse eine leichte spektrale Verbreiterung am Faserausgang, was auf das Vorhandensein von SPM hinweist (Abb. 3e). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kagome-Faser eine effiziente Übertragung ultrakurzer Impulse ermöglichte und die minimalen Verzerrungen, die bei der Übertragung hoher Impulsenergie beobachtet wurden, die chirurgischen Ablationsfähigkeiten der Sonde nicht wesentlich beeinträchtigen sollten.

Nachdem die Fasercharakterisierung abgeschlossen war, simulierten wir die Scanleistung unserer chirurgischen Sonde (Abb. 3f). Die ungleichmäßige Gewichtsverteilung der freitragenden Faserspitze verursachte leichte Schwankungen in den x- und y-Achsen-Resonanzfrequenzen und stellte natürlich die Voraussetzungen für das Lissajous-Scannen dar. Wir haben einen Lissajous-Scan-Algorithmus verwendet, um das Pulsablagerungsprofil über den gesamten chirurgischen ROI27,29 zu simulieren. Das Lissajous-Scanmuster im gewebeseitigen FOV ist definiert durch:

wobei \(d_{x}\), \(d_{y}\) die x- und y-Achsen-Scanbreiten sind und \(\nu_{x}\), \(\nu_{y}\) sind x- bzw. y-Achsenfrequenzen des Piezofaser-Abtastelements. Wir simulierten das Scanmuster, während die Sonde in eine einzelne Querrichtung verschoben wurde, um das Impulsablagerungsprofil abzuschätzen, während die chirurgische Sonde mit konstanter Geschwindigkeit vorgeschoben wurde. Für die erwarteten Operationsparameter: Ablations-FOV 47 × 47 µm2, Fokusstrahlradius \(w_{0} = 0,94\) μm, \(v_{x} ,v_{y} = 942{\text{ Hz, 895 Hz} }\), einer Laserwiederholungsrate von 500 kHz und einer Translationsgeschwindigkeit von ≤ 2 mm/s haben wir geschätzt, dass mindestens 94 % des Sichtfelds mindestens einen Impuls empfangen werden, mit einem Mittelwert von mindestens 15 überlappenden Impulsen pro Punkt.

Wir haben das miniaturisierte Objektiv mithilfe des in Abb. 2c gezeigten Aufbaus charakterisiert. Die Übertragungseffizienz durch die gesamte Sonde betrug 40 % und lag damit etwas unter den erwarteten 46 % (Abb. 3b). Wichtig ist, dass die Transmission durch das Objektiv bei hohen Pulsenergien linear bleibt, was auf eine vernachlässigbare Multiphotonenabsorption innerhalb der Linsen hinweist. Erste Messungen der Punktgröße wurden durchgeführt, indem die Brennebene des Objektivs abgebildet wurde, während ein kollimierter Strahl von unserem Faserlaser in Richtung der hinteren Apertur des Objektivs geleitet wurde, ähnlich den von Jeon et al.33 beschriebenen Studien. Kurz gesagt, ein Kepler-Teleskop reduzierte den Eingangsstrahlradius auf ~ 250 μm, und ein fünfachsiger Tisch wurde verwendet, um das Objektiv entlang des Strahlengangs auszurichten. In diesem Fall haben Zemax-Simulationen einen 1/e2-Brennfleckradius, \(w_{0}\), von 0,95 μm für die Fokussierung in Meerwasser vorhergesagt. Wir haben \(w_{0}\) gemessen, indem wir die Brennebene des miniaturisierten Objektivs mit einem 20-fach-Wasserimmersionsobjektiv (0,95 NA, XLUMPlanFl, Olympus) und einer 400-mm-Tubuslinse auf den Strahlprofiler abgebildet haben. Um die Brennebene des miniaturisierten Objektivs mit der Objektebene des 20-fach-Objektivs auszurichten, haben wir zunächst die Oberfläche eines 170 μm dicken Borosilikatglas-Deckglases mit dem Bildgebungsaufbau abgebildet und dann das miniaturisierte Objektiv bis zum kleinsten Brennpunkt in Richtung des Deckglases verschoben wurde auf dem Strahlprofiler beobachtet. Zwischen Sondenspitze und Deckglas wurde ein Wassertropfen platziert, um die Fokussierung im Gewebe nachzuahmen. Die etwa 42-fache Vergrößerung dieses Aufbaus, die durch die Abbildung von 10-μm-Merkmalen auf einem Mikrometerobjektträger (Nr. 53–713, Edmund Optics) ermittelt wurde, lieferte zusätzlich zur kleinen Pixelgröße des Strahlprofilers (3,69 μm) eine genaue Schätzung des Brennpunkts Punktgröße. Wir ermittelten \(w_{0} = 1,15 \pm 0,09\) μm, was einem Strehl-Verhältnis von ~ 0,81 entspricht und auf eine beugungsbegrenzte Leistung hinweist.

Wir haben ähnliche Experimente mit diesem Bildgebungsaufbau durchgeführt, nachdem wir das miniaturisierte Objektiv mit den Piezofaser- und mechanischen Scanbaugruppen integriert hatten. Zunächst bestimmten wir den idealen Abstand zwischen der Faserspitze und der ersten CaF2-Linse, indem wir die Faserposition sorgfältig anpassten, bis der kleinste Brennfleck auf dem Strahlprofiler beobachtet wurde. Wir haben festgestellt, dass ein Faser-Linsen-Abstand von 2 – 3 mm die beste Leistung liefert und gut mit dem im Zemax-Rezept angegebenen Abstand von 2 mm übereinstimmt. Bei der Verwendung eines benutzerdefinierten Nylon-Abstandshalters, um den Abstand zwischen Faser und Linse in der endgültigen Sondenbaugruppe auf 2 mm einzustellen, ermittelten wir \(w_{0} = 1,12 \pm 0,10\) μm (Abb. 4a), etwa 19 % größer als der Zemax-Schätzung von 0,94 μm. Abweichungen in der Brennpunktgröße können auf eine leichte Elliptizität des fokussierten Strahls zurückzuführen sein (dh komatische und/oder astigmatische Aberrationen, die durch die Neigung der Faser in Bezug auf die optische Achse des Objektivs verursacht werden). Wir ermittelten einen Arbeitsabstand von ~ 105 μm, indem wir den Translationsabstand aufzeichneten, der erforderlich war, um ein scharfes Bild der Sondenspitze relativ zu ihrer Brennebene zu erzeugen, indem wir einen an der Sonde angebrachten manuellen Lineartisch verwendeten, was gut mit dem von Zemax vorhergesagten Arbeitsabstand von 112 μm übereinstimmte . Das Scannen der Faserspitze ± 0,53 mm ergab ein Ablations-FOV von ~ 46 × 46 μm2 (± 0,4 μm), was einer etwa –23-fachen Verkleinerung entspricht, die gut mit der erwarteten Systemverkleinerung von –25 × übereinstimmt (Abb. 4b).

Optische Leistung einer chirurgischen Sonde. (a) Brennpunkt eines miniaturisierten Objektivs, abgebildet mit 20-fachem Wasserimmersionsobjektiv, 400-mm-Tubuslinse und Strahlprofiler. Das Strahlprofil wurde an die Gaußsche Funktion angepasst, um den 1/e2-Fokusstrahlradius (\(w_{0}\)) zu bestimmen. Unsicherheiten stellen 95 %-Konfidenzintervalle für die Gaußsche Anpassung an die vertikalen und horizontalen Profile dar. Der Maßstabsbalken beträgt 1 μm. (b) Binärbild von 46 × 46 μm2 Sichtfeld in der Brennebene der Sonde. (c) Ablation von Borosilikatglas-Deckglas mit chirurgischer Sonde. Die Größe des auf dem Deckglas erzeugten Ablations-FOV stimmt gut mit den Ergebnissen der FOV-Bildgebung überein. (d) Das seitliche Scannen des Deckglases ermöglicht die Bildung eines Ablationsgrabens über die Glasoberfläche. Maßstabsbalken sind 20 μm.

Wir haben vorläufige Glasablationsstudien durchgeführt, um die chirurgischen Fähigkeiten der Sonde zu beurteilen. Wir haben die Brennebene der Sonde mit einem modifizierten Brennebenen-Bildgebungsaufbau, bestehend aus dem 40-fachen Luftimmersionsobjektiv, einer 50-mm-Röhrenlinse und einer CCD-Kamera (Manta G-201, Allied Vision), auf die Oberseite eines Glasdeckglases ausgerichtet. . Zwischen der Sondenspitze und dem Deckglas wurde ein Wassertropfen platziert, um die Fokussierung im Gewebe nachzuahmen, ähnlich wie bei den oben beschriebenen Brennfleckmessungen. Um die Ablation einzuleiten, war eine sorgfältige Ausrichtung erforderlich, da die durch die Strahlfokussierung in Wasser verursachte Blasenbildung die Laserleistungsabgabe an die Oberfläche des Deckglases einschränkte. Bei sorgfältiger Fokussierung auf die Oberfläche des Deckglases konnte mit 360-nJ-Impulsen ein Ablations-FOV von ~ 45 × 48 μm2 (Abb. 4c) erhalten werden, was einer Fluenz entspricht, die ~ 3,5 × größer ist als die Einzelimpuls-Ablationsschwelle von Borosilikatglas45. Ein mechanischer Verschluss steuerte die Laserbelichtungszeit, die für die einzelne FOV-Ablation 0,5 s betrug. Schließlich haben wir einen Graben auf der Oberfläche des Deckglases abgetragen, indem wir das Deckglas stationär gehalten und die Sondenspitze seitlich über eine Distanz von 2 mm mit 1 mm/s verschoben haben (Abb. 4d), während wir den Verschluss in der Mitte des Scans für kurze Zeit geöffnet haben .

Wir haben die Gewebeablationseigenschaften der Sonde anhand herausgeschnittener Schweinekehlköpfe charakterisiert. Um geeignete Laserbetriebsparameter für die Operation auszuwählen, nämlich die Impulsenergie an der Epitheloberfläche, die erforderlich ist, um die Ablation innerhalb der SLP-Schicht des VF einzuleiten, ist eine vorherige Kenntnis der optischen Streueigenschaften des VF erforderlich. Daher haben wir Streulängen und Ablationsschwellen von Schweine-VF mithilfe einer auf ultraschneller Laserablation basierenden Technik gemessen46. Frische Schweinekehlköpfe wurden von einem örtlichen Schlachthof gekauft und innerhalb von 4 Stunden nach der Tötung des Tieres getestet. Für Streulängen- und Ablationsschwellenmessungen extrahierten wir rechteckige Abschnitte der unteren VF-Schleimhaut aus dem mittleren VF, indem wir die Schleimhaut vom darunter liegenden Muskel präparierten. Da frühere Studien darauf hinwiesen, dass sowohl die Dehydrierung des Gewebes als auch die Lagerung in Kochsalzlösung die optische Streuung erheblich beeinflussen können23,47,48, haben wir beschlossen, frische VF-Proben ohne Eintauchen in Kochsalzlösung unmittelbar nach der Exzision zu testen, um die In-vivo-Bedingungen besser nachzuahmen.

Die Oberflächenimpulsenergie \(E_{surf}\), die erforderlich ist, um einen optischen Durchbruch auszulösen und Ablationshohlräume innerhalb des SLP zu bilden, kann wie folgt beschrieben werden46:

Hier ist \(F_{th,SLP}\) die SLP-Fluenzschwelle, \(\ell_{s,ep}\) und \(\ell_{s,SLP}\) die Epithel- und SLP-Streulängen, \ (z_{ep}\) ist die Epitheldicke und \(z_{0} = z - z_{ep}\) ist der Abstand innerhalb des SLP. Nach dem in46 beschriebenen Verfahren haben wir \(\ell_{s,ep} = 147,2 \pm 15,7\) μm, \(\ell_{s,SLP} = 53,8 \pm 3,4\) μm, \(F_{th, ep} = 1,55 \pm 0,08\) J/cm2 und \(F_{th,SLP} = 1,44 \pm 0,15\) (n = 3). Unter der Annahme einer Zieltiefe \(z = 105\) μm und einer durchschnittlichen Schweine-VF-Epitheldicke von ~ 60 μm23,46,48 schätzten wir, dass \(E_{surf} \sim 200\) nJ erforderlich ist, um \(F_{ th,SLP}\). Wir verwendeten Methoden von Subramanian et al. um die Auswirkungen der Selbstfokussierung während der Ablation unter der Oberfläche bei Schweine-VF30 abzuschätzen. Wir haben festgestellt, dass die Fluenzen in der Brennebene niedriger als \(F = 25F_{th,SLP}\) sein müssen, um sicherzustellen, dass die Spitzenleistungen unter der kritischen Leistung für die Selbstfokussierung liegen, vorausgesetzt, dass das miniaturisierte Objektiv eine NA von 0,47 und einen Arbeitsabstand von 105 μm hat sowie eine Pulsbreite des Faserlasers von 1,1 ps. Um die Ablation sicherzustellen und eine Selbstfokussierung zu vermeiden, haben wir auf Fokusebenenfluenzen \(F = 10F_{th,SLP}\), also \(E_{surf} \sim 2\) μJ an der Sondenspitze oder Pulsenergien von ~ 5, abgezielt μJ am Kagome-Fasereingang unter Berücksichtigung der Übertragungsverluste durch die Faser und das Objektiv.

Wir haben die Ablationsleistung der Sonde an exzidierten Hemilaryngen von Schweinen bewertet. Wir erzeugten subepitheliale Hohlräume innerhalb des SLP, indem wir die Sondenspitze über die mediale VF-Oberfläche scannten und dabei das in Abschnitt 3 beschriebene externe Betätigungssystem verwendeten. "Mechanische Konstruktion". Konkret bewegten wir die Sondenspitze in x-Richtung in Schritten von \(h_{x}\) nach jeder Verschiebung um ± 2 mm in y-Richtung, um das Ablations-FOV in einem Pseudorastermuster über einen großen Teilbereich abzutasten. Epithelebene.

Bei ersten Ablationsexperimenten stellten wir einen Defekt im optischen Kleber (NOA-61, Norland Products) fest, der zur Befestigung des Saphirfensters am Prisma verwendet wurde. Während die Fluenz von ≤ 2 mJ/cm2 an dieser Grenzfläche deutlich unter der erwarteten Einzelpuls-Femtosekundenlaser-Schadensschwelle des Klebstoffs lag (die durch die Ablationsschwelle von Polymeren, 1 – 2,6 J/cm, angenähert werden kann)49, vermuten wir Verunreinigungen innerhalb des Klebstoffs wirken als lokalisierte Hotspots, die zur Anhäufung struktureller Defekte führen können, wenn sie den für die Gewebeablation erforderlichen hohen Spitzenleistungen/hohen Spitzenintensitäten ausgesetzt werden. Um dieses Problem weiter zu testen, haben wir NOA-61-Proben vorbereitet und sie Spitzenlaserintensitäten ausgesetzt, die denen ähnelten, die im miniaturisierten Objektiv erwartet wurden. Tatsächlich fanden wir heraus, dass in den NOA-61-Proben nach 5-minütiger Belichtung Defekte auftraten, wenn Impulse mit 1,1 ps und 400 nJ verwendet wurden, die auf einen Punktradius von 35 μm fokussiert waren (10 mJ/cm2, 2 × 1010 W/cm2). Die Reduzierung der Pulsbreite von 1,1 ps auf 500 fs (d. h. eine Erhöhung der Spitzenintensität bei konstanter Fluenz) führte zu Schäden in < 2 Minuten, was darauf hindeutet, dass der Schadenseintritt tatsächlich mit der Spitzenintensität und der Expositionszeit zusammenhängt. Andererseits haben wir festgestellt, dass 5-ps-Pulse nach 30 Minuten keine Schäden in den NOA-61-Proben verursachten, selbst wenn 3 × höhere Fluenzen verwendet wurden. Um eine weitere Schädigung des Objektivs zu vermeiden, verwendeten wir daher für alle nachfolgenden Gewebeablationsexperimente 5-ps-Impulse. Um den Defekt innerhalb des miniaturisierten Objektivs zu beseitigen, haben wir das Saphirfenster vom Prisma getrennt, die verbliebenen NOA-61-Rückstände von beiden Passflächen entfernt und das Fenster wieder an der Prismenoberfläche befestigt. Erfreulicherweise ähnelten die Messungen von Transmission, Spotgröße, Arbeitsabstand und Sichtfeld den Werten vor der Beschädigung, was darauf hindeutet, dass das Objektiv wie vorgesehen funktionieren kann.

Um die optimale Laserfluenz und x-Achsen-Schrittgröße \(h_{x}\) zu bestimmen, die für die großflächige subepitheliale Ablation erforderlich ist, haben wir mehrere Experimente mit unterschiedlichen Parametern durchgeführt. Wir haben festgestellt, dass diese Parameter sorgfältig ausgewählt werden müssen, um eine Ablation der Gewebeoberfläche zu vermeiden. Beispielsweise wurde bei Verwendung von \(E_{surf} \sim 3.6\) μJ fast immer eine Oberflächenablation beobachtet, was den Fluenzen der Brennebene von \(\sim 18F_{th,SLP}\) entspricht, unabhängig von \(h_{x }\). Wenn \(E_{surf} = 2 - 2,5\) μJ (dh \(F = 10F_{th,SLP} - 13F_{th,SLP}\)) und \(h_{x}\) jeweils groß ist Der y-Achsen-Scan erzeugte eine schmale Ablationslinie unter der Oberfläche mit einer Breite, die ungefähr der Breite des Ablations-FOV entspricht (Abb. 5a – c). Wir fanden heraus, dass \(E_{surf} = 2,2\) μJ, \(h_{x} = 40\) μm die gleichmäßigste Abdeckung des Zielbereichs lieferte, ohne die Gewebeoberfläche zu beschädigen (Abb. 5d). In diesem Fall war \(h_{x}\) kleiner als die Ablations-FOV-Breite und die Ablationslinien überlappten sich, um einen großen, kontinuierlichen Hohlraum zu erzeugen. Wie in Abb. 5e und f gezeigt, befanden sich Hohlräume deutlich unterhalb des Epithels und boten Platz für die Injektion von therapeutischem Biomaterial. In diesem Fall befand sich der Hohlraum mittig bei ca. 114 μm unter der Gewebeoberfläche, was gut mit dem gemessenen Arbeitsabstand von ca. 105 μm übereinstimmte.

Gewebeablationsleistung einer chirurgischen Sonde. Subepitheliale Ablation mit (a) \(E_{surf} = 2,5\) μJ, \(h_{x} = 500\) μm, (b) \(E_{surf} = 2,5\) μJ, \(h_ {x} = 90\) μm, (c) \(E_{surf} = 2,5\) μJ, \(h_{x} = 60\) μm und (d) \(E_{surf} = 2,2\) μJ, \(h_{x} = 40\) μm. Maßstabsbalken sind 500 μm. (e) TPAF-Bilder des subepithelialen Hohlraums, erstellt mit \(E_{surf} = 2,2\) μJ, \(h_{x} = 40\) μm. Das mittlere Bild zeigt die Oberseite des Hohlraums 84 μm tief in VF, deutlich innerhalb des SLP. Unten und rechts sind Querschnitte durch die Mittellinien des mittleren Bildes dargestellt. Schwarze Pfeile in Querschnittsbildern zeigen die im mittleren Bild gezeigte Bildebene an. (f) Montage ausgewählter Bilder aus dem Z-Stapel. Epithelzellen sind bis zu einer Tiefe von 60 μm sichtbar und Kollagenfasern sind in tieferen Tiefen sichtbar. Der Hohlraum ist bei 114 μm zentriert und erstreckt sich über ± 30 μm. Maßstabsbalken sind 100 μm.

Wir injizierten ein Rhodamin-markiertes Polyethylenglykol (PEG30)-Hydrogel in behandelte (d. h. abgetragene) und unbehandelte Schweine-VF, um eine verbesserte Biomateriallokalisierung in mit der Sonde erzeugten subepithelialen Hohlräumen zu demonstrieren. Mit dem oben genannten Aufbau und \(E_{surf} \sim 2.2\) μJ, \(h_{x} = 40\) μm wurden große Hohlräume erzeugt (Abb. 6a). Nach der Ablation wurden die Hemilarynge in einen speziellen Injektionsaufbau überführt, der aus einem Druckregler und einem Magnetventil bestand, das an eine 0,5-ml-Spritze mit dem Biomaterial angeschlossen war. Um das Injektionsvolumen präzise zu steuern, steuerte ein benutzerdefiniertes LabView-Programm die Flussdauer durch Öffnen/Schließen des Magnetventils, um die Spritze kurzzeitig unter Druck zu setzen und ein kleines Volumen (~ 10 μl) durch eine 23-G-Injektionsnadel in der Nähe des Hohlraums abzugeben. Wir verwendeten einen dreiachsigen Mikromanipulator (KITE-L, World Precision Instruments LLC), um die Nadelspitze unter das Epithel in der Nähe des abgetragenen Hohlraums einzuführen, und ein fluoreszierendes Stereomikroskop zur Visualisierung während des Injektionsprozesses. Nach der Injektion wurde die Gewebeoberfläche mit Kochsalzlösung gespült und mit Linsentuch abgewischt. Das Biomaterial wurde erfolgreich im subepithelialen Hohlraum lokalisiert (Abb. 6b und 6c). Das injizierte Volumen dehnt sich in den subepithelialen Raum aus, mit vernachlässigbarem Rückfluss auf die VF-Oberfläche. Im Gegensatz dazu neigt Biomaterial, das in unbehandeltes VF (dh ohne Ablation) injiziert wird, zum Rückfluss und zur Ablagerung auf der VF-Oberfläche. Nach dem Spülen und Abwischen sehen wir, dass ein kleiner Teil des injizierten Volumens nicht selektiv in das die Injektionsstelle umgebende VF-Gewebe diffundiert (Abb. 6d).

Injektion von Biomaterial in einen subepithelialen Hohlraum, der mit einer chirurgischen Sonde in exzidiertem Schweine-VF erzeugt wurde. (a) Bild eines ~ 1 × 2 mm2 großen subepithelialen Hohlraums, der mit Oberflächenpulsenergien von \(E_{surf} \sim 2,2\) μJ und x-Achsen-Schrittweiten von \(h_{x} = 40\) erzeugt wurde. μm. Die gesamte Operationszeit betrug ca. 3 Minuten. (b) In (a) gezeigter Hohlraum nach der Biomaterialinjektion. Die Gewebeoberfläche wurde vor der Bildgebung mit Kochsalzlösung gespült und mit Linsentuch abgewischt. Das injizierte Biomaterial kann als hell fluoreszierendes Volumen gesehen werden, das unter der Gewebeoberfläche im subepithelialen Ablationsbereich lokalisiert bleibt, siehe (a). Das rot gepunktete Oval zeigt die Hohlraumgröße vor der Injektion an. Der Ablationshohlraum vergrößert sich, wenn das Biomaterial in den Hohlraum injiziert wird. (c) Bild des gesamten Hemilarynx des Schweins, aufgenommen mit einer Handykamera nach der in (b) gezeigten Biomaterialinjektion. Der rote Bereich ist das injizierte Biomaterial, das im Hohlraum lokalisiert ist. Der helle blaue Bereich ist das Licht des Stereomikroskops. (d) Fluoreszenzbild der Biomaterialinjektion in VF ohne Ablation. Der größte Teil des injizierten Volumens fließt auf die Gewebeoberfläche zurück. Nach dem Spülen und Abwischen der Gewebeoberfläche stellen wir fest, dass eine kleine Menge des Biomaterials nicht selektiv in das umliegende Gewebe diffundiert ist. Maßstabsbalken sind 500 μm in (a), (b), (d) und 5 mm in (c).

Wir stellten ein miniaturisiertes ultraschnelles Laserchirurgiesystem zur Behandlung von VF-Narben vor. Ein Kagome-HCPCF ermöglichte die flexible Lieferung hochenergetischer ultrakurzer Laserimpulse an ein speziell angefertigtes Objektiv mit 6 mm Durchmesser und erzeugte einen fokalen Strahlradius von 1,12 ± 0,10 μm über ein Ablations-FOV von ~ 46 × 46 μm2. Die von der Sonde bereitgestellte enge Strahlfokussierung ermöglichte zusätzlich zu einem Arbeitsabstand von ~ 105 μm eine Fokussierung und Ablation unter der Oberfläche unterhalb des VF-Epithels. Auf dem Weg zu einem klinisch brauchbaren Chirurgiesystem haben wir die Sonde in ein externes Betätigungssystem integriert, das aus einem beweglichen mechanischen Arm und mehreren hochpräzisen automatisierten Tischen besteht, was eine flexible Positionierung der Sonde während zukünftiger In-vivo-Studien ermöglichen soll.

Wir beurteilten die chirurgische Leistung der Sonde, indem wir parametrische Ablationsstudien an frischen Hemilaryngen von Schweinen durchführten. Wir haben festgestellt, dass die Laserparameter während der Operation sorgfältig ausgewählt werden müssen, um Schäden an der Gewebeoberfläche und der Sonde selbst zu vermeiden. Darüber hinaus ermöglichte das automatisierte Scannen der Sondenspitze/Ablations-FOV über die Gewebeoberfläche/Subepithelebene die Erzeugung großer, kontinuierlicher Hohlräume. Insbesondere könnten wir große Hohlräume erzeugen, wenn wir 5 ps, 2,2 μJ-Pulse verwenden und das Ablations-FOV in Schritten von 40 μm über eine Fläche von 1 × 2 mm2 verschieben. Wir haben bestätigt, dass Ablationshohlräume unterhalb des Epithels lokalisiert waren; Die TPAF-Bildgebung zeigte, dass die Hohlräume etwa 114 μm unter der Gewebeoberfläche zentriert waren, was gut mit dem Zemax-Design und den Arbeitsabstandsmessungen übereinstimmte. Schließlich demonstrierten wir die Lokalisierung eines Modellbiomaterials in subepithelialen Hohlräumen, die mit der miniaturisierten Sonde erzeugt wurden, was darauf hindeutet, dass das hier vorgestellte chirurgische System zur Behandlung von Stimmlippennarben im klinischen Umfeld eingesetzt werden kann. Zukünftige Studien werden die Sonde in eine klinisch geeignete Workstation integrieren, um die Durchführbarkeit unserer Stimmlippennarbentherapie in vivo zu bewerten.

Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health (NIH) Grant Nr. unterstützt. R01-DC014783 und die National Science Foundation (NSF) Grant No. 1805998. Wir möchten Dr. James Kobler, Dr. Sandeep Karajanagi und Dr. Steven Zeitels für die Bereitstellung des in diesen Studien verwendeten Rhodamin-markierten PEG30 danken. Wir möchten auch Dr. Kaushik Subramanian für seine erste Diskussion bei der Gestaltung der Chirurgiesonde danken.

Abteilung für Biomedizintechnik, University of Texas at Austin, Austin, TX, 78712, USA

Liam Andrews und Adela Ben-Yakar

Abteilung für Bioingenieurwesen, Rice University, Houston, TX, 77005, USA

Hamin Jeon, Michal Pawlowski & Tomasz Tkaczyk

GPPMM Group, XLIM, CNRS-Universität Limoges, Limoges, Frankreich

Benoit Debord, Frederic Gerome und Fetah Benabid

Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie, Southwestern Medical Center der University of Texas, Dallas, TX, 75390, USA

Ted Mau

Fakultät für Maschinenbau, University of Texas at Austin, Austin, TX, 78712, USA

Adela Ben-Yakar

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LA, TM und AB haben die Experimente entworfen. LA führte Experimente durch. LA und AB haben das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren geschrieben. HJ, MP und TT haben das miniaturisierte Objektiv entworfen und hergestellt. BD, FG und FB haben die Glasfaser entwickelt und hergestellt. AB überwachte das Gesamtprojekt.

Korrespondenz mit Adela Ben-Yakar.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Andrus, L., Jeon, H., Pawlowski, M. et al. Ultraschnelle Laserchirurgiesonde für die Ablation unter der Oberfläche, um die Injektion von Biomaterial in die Stimmlippen zu ermöglichen. Sci Rep 12, 20554 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24446-5

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Eingegangen: 09. September 2022

Angenommen: 15. November 2022

Veröffentlicht: 29. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24446-5

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